洁净实验室厌氧菌的别离、培育及判定

一摘要：

1．1试验内容：

厌氧菌的别离、培育及判定；

1．2意图：

1把握厌氧菌的别离、培育及活菌计数的一般办法。

打听厌氧菌菌判定的一般办法。

2温习并稳固平常所学的微生物常识与技能。

3培育独立思考、描绘和着手试验的才能。

二引见：

厌氧微生物在自然界散布广泛，品种繁复，其生理效果日益遭到大家的注重。

专性厌氧菌，对氧气十分灵敏，因而，他们的别离、培育及活菌计数的关键是供给无氧和低氧化复原电势的培育环境。

厌氧菌的培育：

在培育厌氧菌时，最需求操控的是厌氧条件，在pH=7.0,O2的浓度与1atm的氧平衡时，O2——O2-反响的电位是0.81V，因而，在-0.33V时，O2浓度是大气压中O2浓度的10-75。每升饱和了空气的水中富含1.48×10-55个O2。所以说，要包管厌氧菌培育时的低电位是很重要的。

厌氧菌的培育办法许多，如厌氧箱法、厌氧袋法、厌氧罐法。这些办法都需求特定的除氧办法，操作步调多，较繁琐。本试验引见的是一种简洁的试管培育法——亨盖特厌氧滚管技能，亨盖特厌氧滚管技能是美国微生物学家亨盖特于1950年初次提出并应用于瘤胃厌氧微生物研讨的一种厌氧培育技能因而他是世界上第一个别离纯化厌氧菌的人。

今后这项技能又阅历了几十年的不断改进，从而使亨盖特厌氧技能日趋完善，并逐步开展成为研讨厌氧微生物的一套完好技能，并且多年来的理论现已证明它是研讨严厉、专性厌氧菌的一种极为有用的技能。该技能的长处是：预复原培育基制好后，可随时取用进行试验；任何时刻调查或查看试管内的菌种都不会搅扰厌氧条件。

三试验资料与设备：

3．1别离与培育：

3．1．1菌种：待测样品；

3．1．2培育基：改进的PRAS培育基(氮素自加)

[配方组成——NH4CL1g,MgCl20.1g,K2HPO40.4g,KH2PO40.2g,甲酸钠5g,乙酸钠5g,甲醇3.5ml,Ph值为7.0,蒸馏水1000ml,1%的树脂刃天青(复原指示剂)1ml,121摄氏度灭菌20min.运用前每5ml培育基参加1%Na2S(复原剂)和5%NaHCO3及3000u/ml青霉素液(抑制剂)各0.1ml]

3．1．3试剂：冰块Na2SNaHCO3

3．1．4器件：高纯氮气厌氧管厌氧手套箱注射器恒温培育箱铜柱除氧体系定量加样器厌氧罐超声波破碎仪酒精灯冰块水浴锅记号笔振荡器等

3．2菌种的判定：

3．2．1菌种：待测菌

3．2．2培育基；糖发酵培育基、蛋白胨水培育基、淀粉培育基(液体)；

3．2．3试剂；乙醚吲哚试剂卢戈氏碘液；

3．2．4器件：超净工作台恒温培育箱高压蒸汽灭菌锅接种环移液管载玻片显微镜等

四、试验办法与步调：

4．1别离与培育

4．1．1铜柱体系除氧

铜柱是一个内部装有铜丝或铜屑的硬质玻璃管。此管的巨细为40～400mm，两头被加工成漏斗状，外壁绕有加热带，并与变压器相连来操控电压和安稳铜柱的温度。铜柱两头衔接胶管，一端衔接气钢瓶，另一端衔接出气管口。因为从气钢瓶出来的气体如N2、CO2和H2等都富含微量O2，故当这些气体经过温度约360℃的铜柱时，铜和气体中的微量O2化合生成CuO，铜柱则由亮堂的黄色变为黑色。当向氧化状的铜柱通入H2时，H2与CuO中的氧就联系构成H2O，而CuO又被复原成了铜，铜柱则又出现亮堂的黄色。此铜柱可以重复的运用，并不断起到除氧的意图。当然H2源也可以由氢气发生器发生。

4．1．2预复原培育基及稀释液的制备

在无氧无菌的超净厌氧手套箱中的条件下，制造预复原培育基及稀释液时，先将装备好的培育基和稀释液煮沸驱氧，而后用半定量加样器趁热分装到螺口厌氧试管中，一般琼脂培育基装4.5～5.0mL，稀释液装9mL，并刺进通N2气的长针头以扫除O2。此刻可以清晰的看到培育基内参加的氧化复原指示剂—刃天青由蓝到红最终变成无色，阐明试管内已成为无氧状况，然后盖上螺口的丁烯胶塞及螺盖，于灭氧罐中灭菌备用。

4．1．3别离

(1)编号

取五支无菌水试管，分别用记号笔标明10-1、10-2……10-5。

(2)稀释

在无氧无菌的超净厌氧手套箱中的条件下，用无菌注射器汲取1mL混合均匀的液体样品，参加装有预复原生理盐水的厌氧试管中，用震动器将其混合均匀，制成10-1稀释液。用无菌注射器汲取1mL10-1稀释液至另一装有9mL生理盐水的厌氧试管中，制成10-2稀释液。依此进行10倍系列稀释，至10-6，制成不一样样品稀释液。一般选10-4、10-5、10-6三个稀释度进行滚管计数。